מדריך לעבודה עם וקטור נגיף לנטי

עודכן 09.09.2021

נגיף לנטי (Lenti Virus) הוא נגיף ממשפחת ה- Retroviridae, המאופיין בתקופת אינקובציה ממושכת. נגיפי לנטי (HIV, SIV,FIV) כולם פתוגניים לאדם. נגיפים אלו יכולים להעביר כמות משמעותית של תוכן גנטי לתוך ה- DNA של תא המטרה, הן לתוך תא בחלוקה והן לתא שאינו בחלוקה (בניגוד לנגיפי רטרו המדביקים תאים מתחלקים בלבד).
המעטפת הטבעית של נגיף לנטיHIV-1) מכילה גליקופרוטאין Gp120 הספציפי ל(Tcells על מנת להרחיב את טווח תאי המטרה של הוקטור הנגיפי, הוכנס לו גליקופרוטאין של Vesicular stomatitis virus (VSVG).
תכונות אלו הופכות את השימוש בנגיף הלנטי לשיטה היעילה ביותר להחדרת חומר גנטי לתא, להחלפת חומר גנטי פגום או חסר בריפוי גנטי וכן במחקר בסיסי להכנסת גנים משתיקים למערכות שונות. שיטה זו טובה מאוד לטרנספקציה יעילה, לסימון in vivo לחיות טרנסגניות ועוד.

השימוש בווקטור המבוסס על נגיף לנטי מעורר סוגיות של בטיחות לעובד ולסביבה. קבוצת הסיכון הם העובדים עם הווקטורים.

חדירת נגיף לגוף יכולה להתרחש:

  1. דרך העור – על ידי דקירה או ספיגה דרך חתך, פצע או גרוי בעור.
  2. דרך הריריות – עיניים, אף, פה.

יישום קפדני של ההוראות המובאות להלן ימנע חשיפת העובד.

העיקרון הבסיסי הינו הימנעות מזיהום באמצעות טיפות/תרסיס/דקירה מחפצים חדים. לפיכך למניעת חשיפה:

  1. אין לעבוד עם כלים חדים או העשויים מזכוכית (יש להשתמש רק בפיפטות עשויות פלסטיק, מחט קטומה וכדומה).
  2. סרכוז יתבצע רק בצנטריפוגת ביוהאזאד.
  3. סינון יבוצע באמצעות ממברנה המורכבת במערכת תת לחץ (לפרטים פנה לממונה הבטיחות הביולוגית).
  4. העבודה תתבצע במנדף ביולוגי.

עפ"י החלטת ועדת בטיחות ביולוגית מכונית, העבודה עם וקטור לנטי תתבצע בחדר מחלקתי מיועד או בחדר תרביות רקמה של קבוצת המחקר (לאחר שאושר לשמש לעבודה עם וקטור לנטי על ידי ממונה הבטיחות הביולוגית) ובאחריות ראש הקבוצה. חדר התרביות הקבוצתי חייב להתנהל כולו לפי ההוראות מעלה גם כאשר לא מפיקים לנטי.

אנו ממליצים להשתמש בפלסמידים מהדור השלישי המאפשרים יצירת נגיף חסר יכולת התרבות, למשל Invitrigen Virapower, המומלץ על ידי מכוני הבריאות האמריקאים. מערכת זו כוללת מספר אמצעי בטיחות:

  1. הגן tat, החיוני להפעלת שעתוק גנים ויראליים, אינו מבוטא במערכת זו.
  2. הוקטור עובר השבתה עצמית מפעולה עקב חסר ב 3'LTR (U3).
  3. הגנים המקודדים לחלבונים מבניים ופונקציונליים חיוניים הוצאו מהוקטור ומוספים באופן זמני באמצעות שלושה פלסמידים (gag-pol , rev , VSV-G). ריבוי הפלסמידים (סה"כ ארבעה פלסמידים) מפחית את הסיכון ליצירת וקטור בעל יכולת התרבות.

העובדים עם לנטי דור 2 (סה"כ 3 פלסמידים) חייבים לבדוק בכל הפקה חדשה כי וקטור הלנטי אינו בר התרבות שכן כל הפקה הינה אירוע הסתברותי חדש (פרטים אצל ממונה הבטיחות הביולוגית).

 

נוהל עבודה עם לנטי וירוס

 

  1. ציוד חיוני בחדר בו מבוצעת עבודה בווקטורי לנטי:
  • מנדף ביולוגי (class II)
  • צנטריפוגה ביוהזארד
  • מיקרוסקופ
  • אינקובטור
  • ציוד לפסולת ביולוגית
  • מערכת מיקרו פיפטורים
  • ערכת טיפול בשפך הכוללת מגן פנים וערדליים
  1. כניסה לחדר:
    1. הגבלת הכניסה למורשים בלבד.
    2. על דלת החדר יוצב שילוט המציין: עבודה עם נגיף לנטי (ניתן להשיג ביחידת הבטיחות).

 

  1. לפני תחילת העבודה:
    1. הכן תמיסות חיטוי (ראה סעיף חיטוי).
    2. הכן שקית "ביוהזרד" בתוך המנדף ושקית נוספת בתוך דלי פסולת "ביוהזרד".
    3. לבש ציוד מיגון אישי: חלוק חד פעמי, 2 זוגות כפפות ומשקפי מגן.

את הכפפות החיצוניות יש להניח על שרוול החלוק על מנת להגן על אזור חיבור האמה לכף היד, או לעטות בשרוול חד פעמי עמיד למים מעל החלוק .

יש להוסיף למיגון זה מסכת פנים (surgical face mask) כאשר עם הווירוס מתבצעת עבודה כגון: איסוף/סינון/סרכוז/הדבקת תאים במנדף ביולוגי וכאשר הסיכון הוא זיהום הריריות באמצעות הידיים. ציוד מגן זה נקבע על סמך סקר סיכונים ובמטרה למנוע חשיפה דרך הריריות.

עבודה היוצרת אירוסולים ואין אפשרות לבצעה במנדף : יש להתייעץ עם יחידת הבטיחות על מנת לבצע סקר סיכונים ובמקרה הצורך להוסיף ציוד מגן אישי נוסף.

  1. במהלך העבודה:
    1. שמור על דלת חדר התרביות סגורה כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.
    2. יש להשתמש בטיפים ופיפטות בעלי פילטר.
    3. אין לעבוד עם כלים חדים או העשויים מזכוכית.
    4. יש לחטא ציוד חד פעמי (פיפטות, צלחות) לפני השלכתו לשקית ביוהזרד (ראה פרטים מטה).
    5. אין להכניס וקטורים או נגיפים אחרים למנדף כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.
    6. אין להשאיר תמיסות המכילות נגיף, במנדף או בצנטריפוגה, ללא השגחה.
    7. אין לצאת ממעבדת לנטי עם החלוק אתו בוצעה העבודה עם הנגיף. ניתן להשאיר את החלוק החד פעמי בחדר הלנטי. בתום העבודה יש לזרוק את החלוק החד פעמי והכפפות בשקית ביוהזרד. מומלץ להכניסם לשקית חדשה.
    8. במידה והאינקובטור משמש לגידול תרביות תאים שאינן מודבקות בוקטור לנטי, מומלץ לגדל את תרביות התאים המודבקים בוקטור לנטי במדף התחתון של האינקובטור. יש להניח את צלחות תרביות התאים המודבקות בוקטור לנטי  במגש,  במטרה להכיל שפך לא מתוכנן באינקובטור.
    9. לפני הוצאת הידיים מהמנדף יש להחליף כפפות חיצוניות  (ולזרוק אותן בשקית הביוהזרד במנדף). אין לגעת בציוד ומשטחים מחוץ למנדף בכפפות מזוהמות.
    10. סרכוז יבוצע בצנטריפוגת ביוהזארד או במבחנות סגורות עם אטם למניעת היווצרות תרסיס.
    11. כל תהליך הכולל שימוש במכשור המוצב מחוץ לחדר תרביות/לנטי, או עבודה על שולחן המעבדה (למשל,FACS , מיקרוסקופיה, קצירת תאים), ניתן לבצע לאחר  ארבע שטיפות לתאים במדיום. שטיפה זו מבטיחה שמספר הוירוסים הנותרים בצלחת הינו פחות מהמנה הנדרשת להדבקה
    12. שימוש באולטרה צנטריפוגה הממוקמת בחדר אחר יבוצע על פי ההוראות הבאות:
  • הצג שילוט המציין עבודה עם נגיף לנטי, משך העבודה, שמך ומספר טלפון נייד.
  • אין למלא מעבר ל75% מנפח המבחנה.
  • אזן את המבחנות בשקילה בתוך המנדף בחדר הלנטי.
  • הנח בזהירות את המבחנות בתוך מיכלי המתכת.
  • סגור את מיכלי המתכת בעזרת פקק מתכת מתאים (מכיל אטם).
  • נקה את החלק החיצוני של המיכל עם אתנול 70% והחלף כפפות. הבא את המבחנות הסגורות לאולטרה צנטריפוגה המחלקתית בתוך מעמד.
  • בתום הצנטריפוגציה, פתח את המבחנות בתוך המנדף .
  • חטא את מיכלי הצנטריפוגה (מבפנים ומבחוץ), הרוטור וקיר הצנטריפוגה עם אתנול 70%, או עם מטליות ייעודיות גם אם לא הבחנת בשפך.

 

  1. עם סיום העבודה יש:
  • לשטוף את צינור הגומי של משאבת הואקום בתמיסת סודיום היפוכלוריט מהולה  1:10 (0.6%).
  • לחטא את הפסולת המוצקה והנוזלית ולפנות אותן כמפורט מטה.
  • לנקות את המנדף, ידית האינקובטור וכל מכשור אחר שנעשה בו שימוש (מקרוסקופ, צנטריפוגה וכו') באתנול 70% .
  • לשטוף ידיים עם סבון ומים (במשך עשרים שניות לפחות).

 

חיטוי וטיפול בשפך המכיל לנטי

חיטוי:

אמצעי החיטוי המקובל הוא סודיום היפוכלוריט, המצוי במחסן הכימיקלים כתמיסת 6% סודיום היפוכלוריט, מספר קטלוגי 020015987.

  • שמור במנדף בקבוק המכיל תמיסה טרייה של 0.6% סודיום היפוכלוריט (החומר מאבד מפעילותו לאחר שנמהל ואינו פעיל תוך שבוע בלבד).
  • הכן בקבוק המכיל אתנול 70%.

חיטוי פסולת מוצקה: יש לחטא ציוד חד פעמי (כגון: טיפים, פיפטות, בקבוקים, צלוחיות) במיכל המכיל 0.6% סודיום היפוכלוריט. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר ולהעביר את הפסולת המוצקה  לשקית ביוהזרד. יש לסגור את השקית היטב (אך לא לאטמה) ולפנותה, כשהיא בתוך פח הביוהזרד, למיכל הפסולת המחלקתי.

חיטוי פסולת נוזלית:

נפחים הקטנים מ 500 מ"ל ניתן לחטא בתוך המנדף בבקבוקי פלסטיק (למשל בקבוקי מדיום או PBS) המכילים עשירית מהנפח תמיסת סודיום היפוכלוריט 6%. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר. יש לשים לב שהפסולת אותה משליכים לכיור אינה מכילה טיפים שיסתמו את ביוב הכיור, מומלץ להשתמש במסננת.

נפחים הגדולים מ 500 מ"ל יש לחטא במלכודת המחוברת למערכת שאיבה והמוגנת על ידי מערכת "מלכודת" כפולה ופילטר 0.2 מיקרון (Midisart® 2000 מק"ט 17805 UPN). על המלכודת להכיל עשירית הנפח תמיסת סודיום היפוכלוריט 6%. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר.

טיפול בשפך קטן

כסה את השפך בנייר מגבת ובזהירות שפוך על הנייר, מהחוץ פנימה, תמיסת 0.6% סודיום היפוכלוריט. אסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד.

טיפול בשפך גדול

עטה מסיכה 8835, כסה את נעליך בערדליים וחבוש משקפי מגן או מגן פנים למניעת התזה תוך כדי תהליך הטיהור. כסה את השפך בנייר מגבת ובזהירות, שפוך על הנייר, מהחוץ פנימה, תמיסת 6% סודיום היפוכלוריט (1/10 של נפח השפך).  אסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד. במקרה הצורך חייג 2999 לקבלת עזרה.

במקרה של חשיפה עורית, רחץ פעמיים את האזור הנגוע במים וסבון למשך 30 שניות לפחות. דווח למוקד (2999) ולראש הקבוצה.

במקרה של נתז לעין, שטוף עם מים במשך 15 דקות לפחות. דווח למוקד (2999) ולראש הקבוצה, יש להתייעץ עם רופא.