מדריך לעבודה עם וקטור נגיף לנטי

עודכן 01.03.2020

נגיף לנטי (Lenti Virus) הוא נגיף ממשפחת ה- Retroviridae, המאופיין בתקופת אינקובציה ממושכת. נגיפי לנטי (HIV, SIV,FIV) כולם פתוגניים לאדם. נגיפים אלו יכולים להעביר כמות משמעותית של תוכן גנטי לתוך ה- DNA של תא המטרה, הן לתוך תא בחלוקה והן לתא שאינו בחלוקה (בניגוד לנגיפי רטרו המדביקים תאים מתחלקים בלבד).
המעטפת הטבעית של נגיף לנטי HIV-1)) מכילה גליקופרוטאין  Gp120 הספציפי לTcells על מנת להרחיב את טווח תאי המטרה של הוקטור הנגיפי, הוכנס לו גליקופרוטאין של  Vesicular stomatitis virus(VSVG).
תכונות אלו הופכות את השימוש בנגיף הלנטי לשיטה היעילה ביותר להחדרת חומר גנטי לתא, להחלפת חומר גנטי פגום או חסר בריפוי גנטי וכן במחקר בסיסי להכנסת גנים משתיקים למערכות שונות. שיטה זו טובה מאוד לטרנספקציה יעילה, לסימון in vivo לחיות טרנסגניות ועוד.

השימוש בוקטור המבוסס על נגיף לנטי מעורר סוגיות של בטיחות לעובד ולסביבה. קבוצת הסיכון הם העובדים עם הוקטורים.

חדירת נגיף לגוף יכולה להתרחש:

  • דרך העור – על ידי דקירה או ספיגה דרך חתך, פצע או גרוי בעור.
  • דרך הריריות – עיניים, אף, פה.

יישום קפדני של ההוראות המובאות להלן ימנעו חשיפת העובדים

העיקרון הבסיסי הינו הימנעות מזיהום באמצעות טיפות/תרסיס/דקירה מחפצים חדים. לפיכך למניעת חשיפה:

  1. כל העבודה תתבצע בכלים שאינם חדים (פיפטות עשויות פלסטיק, מחט קטומה)
  2. סינון יבוצע באמצעות ממברנה המורכבת במערכת תת לחץ (פרטים ביחידת הבטיחות)
  3. העבודה תתבצע במנדף ביולוגי.

    עפ"י החלטת ועדת בטיחות ביולוגית מכונית, העבודה עם וקטור לנטי תתבצע בחדר תרביות של קבוצת המחקר (חדר המשמש גם כחדר תרביות רקמה רגיל) או בחדר מחלקתי.

    אנו ממליצים להשתמש בפלסמידים מהדור השלישי המאפשרים יצירת נגיף חסר יכולת התרבות, למשל  Invitrigen Virapower המומלץ על ידי מכוני הבריאות האמריקאים. מערכת זו כוללת מספר אמצעי בטיחות:

  • הגן  tat אינו מבוטא במערכת זו.
  • הוקטור עובר השבתה עצמית מפעולה עקב חסר ב 3'LTR (U3)
  • הגנים המקודדים לחלבונים מבניים וחיוניים הוצאו ומוספים באופן זמני באמצעות פלסמידים.
  • הפלסמידים המוספים:  gag-pol  (בפלסמיד אחד), rev פלסמיד שני. הפלסמיד השלישי VSV-G(מאפשר הכרה ע"י מרבית סוגי התאים).

המערכת הבטיחותית ביותר הינה של הדור השלישי (ארבעה מרכיבים: שלושה פלסמידים + וקטור) העובדים עם לנטי דור 2 חייבים לבדוק בכל הפקה חדשה כי וקטור הלנטי אינו בר התרבות (פרטים ביחידת הבטיחות).

נוהל עבודה עם לנטי וירוס

ציוד ונהלי עבודה

  1. ציוד חיוני בחדר בו מבוצעת עבודה בווקטורי לנטי:
  • מנדף ביולוגי (class II)
  • צנטריפוגה ביוהזארד
  • מיקרוסקופ
  • אינקובטור
  • ציוד לפסולת ביולוגית
  • מערכת מיקרו פיפטורים
  • ערכת טיפול בשפך הכוללת מגן פנים וערדליי
  1. כניסה לחדר:
  • הגבלת הכניסה למורשים בלבד
  • על דלת החדר יוצב שילוט המציין: עבודה עם נגיף לנטי
  1. לפני תחילת העבודה:
  • לבש חלוק מעבדה (עדיף חד פעמי) ושני זוגות כפפות. את הכפפות החיצוניות יש להניח על שרוול החלוק על מנת להגן על אזור חיבור האמה לכף היד. ניתן ללבוש מעל החלוק שרוול חד פעמי עמיד למים.
  • הכן תמיסת חיטוי (ראה סעיף חיטוי)
  • הכן שקית "ביוהזרד" בתוך המנדף ושקית נוספת בתוך דלי פסולת "ביוהזרד"
  • שמור על דלת חדר התרביות סגורה כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.
  • במהלך העבודה ציוד המיגון האישי יכלול: חלוק חד פעמי, 2 זוגות כפפות ומשקפי מגן. יש להוסיף למיגון זה מסכת פנים (surgical face mask) כאשר מתבצעת עבודה עם הוירוס כגון: איסוף/סינון/סרכוז/הדבקת תאים במנדף ביולוגי וכאשר הסיכון הוא זיהום הריריות באמצעות הידיים. ציוד מגן זה נקבע על סמך סקר סיכונים ובמטרה למנוע חשיפה דרך הריריות.
  • עבודה היוצרת אירוסולים ואין אפשרות לבצעה במנדף : יש להתייעץ עם יחידת הבטיחות על מנת לבצע סקר סיכונים ובמקרה הצורך להוסיף ציוד מגן אישי נוסף.

4.  יש להשתמש בטיפים ופיפטות בעלי פילטר. יש לאסוף את הטיפים המשומשים לתוך בקבוק פלסטיק (בקבוק מדיום ריק ונקי) ולפנות את הבקבוק הסגור לשקית פסולת ביולוגי

5.  אין להכניס וקטורים או נגיפים אחרים למנדף כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.

6. אין להשאיר תמיסות המכילות נגיף, במנדף או בצנטריפוגה, ללא השגחה.

7. אין לעבור ממעבדת לנטי למעבדה אחרת עם החלוק בו עבדתם עם הנגיף. ניתן להשאיר את החלוק החד פעמי בחדר הלנטי.

8. במידה שבחדר עובדים גם עם תרביות תאים, יש להציב את צלחות הלנטי במדף התחתון של האינקובטור כשהם נתונים במגש (כגון מכסה צלחת גדולה) זאת במטרה להכיל שפך לא מתוכנן באינקובטור.

9. סרכוז יבוצע בצנטריפוגת ביוהזארד או במבחנות סגורות עם אטם למניעת היווצרות תרסיס.

10. עם סיום העבודה במנדף יש להחליף כפפות חיצוניות. אין לגעת בציוד ומשטחים מחוץ למנדף בכפפות מזוהמות.

11. שימוש באולטרה צנטריפוגה הממוקמת בחדר אחר יבוצע על פי ההוראות הבאות:

  • הצג שילוט המציין עבודה עם נגיף לנטי, משך העבודה, שמך ומספר טלפון נייד.
  • מלא את מבחנות הפלסטיק לא מעבר ל75% מנפח המבחנה.
  • אזן את המבחנות בשקילה בתוך המנדף בחדר הלנטי.
  • הנח בזהירות את המבחנות בתוך מיכלי המתכת.
  • סגור את מיכלי המתכת בעזרת פקק מתכת מתאים (מכיל אטם).
  • נקה את החלק החיצוני של המיכל עם אתנול 70%, החלף לכפפות נקיות ולחלוק נקי (השאר את החלוק והנשמית המשומשים בחדר הלנטי).
  • הבא את המבחנות הסגורות לאולטרה צנטריפוגה המחלקתית בתוך מעמד.
  • בתום הצנטריפוגציה, פתח את המבחנות בתוך המנדף .
  • חטא את מיכלי הצנטריפוגה, הרוטור וקיר הצנטריפוגה עם אתנול 70%, גם אם לא הבחנת בשפך.

12. לצורך בצוע תהליך הכולל שימוש במכשור המוצב מחוץ לחדר תרביות/לנטי, או עבודה על שולחן במעבדה (למשל FACS, מיקרוסקופיה, קצירת תאים), יש לשטוף את התאים במדיום ארבע פעמים (בעדינות ע"מ לא לאבד תאים). שטיפה זו מבטיחה שמספר הוירוסים הנותרים בצלחת הינו פחות מהמנה הנדרשת להדבקה.

13. טיפול בפסולת מוצקה: יש לחטא ציוד חד פעמי כגון פיפטות, בקבוקים, צלוחיות, לפני העברתו לשקית הפסולת (פרטים מטה).

14. טיפול בפסולת נוזלית:

  • נפחים הקטנים מ 500 מ"ל ניתן לחטא בתוך המנדף בעזרת בבקבוקי פלסטיק (בקבוק מדיום 500 מל') המכילים עשירית מהנפח תמיסת סודיום היפוכלוריט 6%. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר. יש לשים לב שהפסולת אותה משליכים לכיור אינה מכילה טיפים שיסתמו את ביוב הכיור.
  • נפחים הגדולים מ 500 מ"ל יש לחטא במלכודת המחוברת למערכת שאיבה והמוגנת על ידי מערכת "מלכודת" כפולה. החיטוי יעשה תמיסת סודיום היפוכלוריט במיהול סופי 1:10 כמצוין מטה

15.  עם סיום העבודה יש:

  • לשטוף את צינור הגומי בתמיסת סודיום היפוכלוריט מהולה 1:10.
  • לפנות את הפסולת הנוזלית כמפורט מעלה.
  • לסגור את שקית הפסולת המוצקה ולפנותה למיכל הפסולת המחלקתי.
  • לנקות את המנדף ואת ידית האינקובטור באתנול 70% .
  • לשטוף ידיים עם סבון ומים (עשרים שניות).

חיטוי וטיפול בשפך המכיל לנטי

חיטוי:

אמצעי החיטוי המקובל הוא סודיום היפוכלוריט , שמצוי במחסן הכימיקלים כתמיסת 6% סודיום היפוכלוריט, מספר קטלוגי 020015987.

  • שמור במנדף בקבוק המכיל תמיסה טרייה של 0.6% סודיום היפוכלוריט (נשמר למשך חודש בלבד).
  • הכן בקבוק המכיל אתנול 70%.

חיטוי פסולת נוזלית

פסולת נוזלית יש לטהר ב0.6% סודיום היפוכלוריט – ריכוז סופי בנפח הפסולת, למשך חצי שעה.

חיטוי פסולת מוצקה

פיפטות משומשות יש לטבול למשך 30 דקות במיכל המכיל 0.06% סודיום היפוכלוריט (נפח התמיסה במיכל צריך להספיק לכיסוי קצה הפיפטה) ולאחר מכן להעביר לשקית ביוהזרד לסילוק כפסולת ביולוגית.

צלחות ובקבוקים יש לטהר עם תמיסת 0.6% סודיום היפוכלוריט למשך 30 דקות, ולאחר מכן להעביר לשקית ביוהזרד לסילוק כפסולת ביולוגית.

טיפול בשפך קטן

כסה את השפך בנייר מגבת ובזהירות שפוך על הנייר תמיסת 0.6% סודיום היפוכלוריט. אסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד.

טיפול בשפך גדול

כסה את נעליך בערדליים וחבוש מגן פנים למניעת התזה תוך כדי תהליך הטיהור.  כסה את השפך בנייר מגבת ובזהירות שפוך על הנייר תמיסת 6% סודיום היפוכלוריט (1/10 של נפח השפך). אסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד. במקרה הצורך חייג 2999 לקבלת עזרה.

טיפול בנתזים

כסה את השטח עם נייר מגבת, שפוך תמיסת 0.06% סודיום היפוכלוריט או אתנול 70% . אסוף את נייר המגבת לתוך שקית ביוהזרד.