מדריך לעבודה עם וקטור נגיף לנטי

עודכן 09.09.2021

נגיף לנטי Lenti Virus הוא נגיף ממשפחת ה Retroviridae המאופיין בתקופת אינקובציה ממושכת. נגיפי לנטי (HIV, SIV,FIV) כולם פתוגניים לאדם. נגיפים אלו יכולים להעביר כמות משמעותית של תוכן גנטי לתוך ה- DNA של תא המטרה, הן לתוך תא בחלוקה והן לתא שאינו בחלוקה (בניגוד לנגיפי רטרו המדביקים תאים מתחלקים בלבד).
המעטפת הטבעית של נגיף לנטיHIV-1) מכילה גליקופרוטאין Gp120 הספציפי ל(Tcells על מנת להרחיב את טווח תאי המטרה של הוקטור הנגיפי, הוכנס לו גליקופרוטאין של Vesicular stomatitis virus (VSVG).
תכונות אלו הופכות את השימוש בנגיף הלנטי לשיטה היעילה ביותר להחדרת חומר גנטי לתא, להחלפת חומר גנטי פגום או חסר בריפוי גנטי וכן במחקר בסיסי להכנסת גנים משתיקים למערכות שונות. שיטה זו טובה מאוד לטרנספקציה יעילה, לסימון in vivo לחיות טרנסגניות ועוד.

השימוש בווקטור המבוסס על נגיף לנטי מעורר סוגיות של בטיחות לעובד ולסביבה. קבוצת הסיכון הם העובדים עם הווקטורים.

חדירת נגיף לגוף יכולה להתרחש:

  1. דרך העור: על ידי דקירה או ספיגה דרך חתך, פצע או גירוי בעור.
  2. דרך הריריות: עיניים, אף, פה.

יישום קפדני של ההוראות המובאות להלן ימנע חשיפת העובד.

העיקרון הבסיסי הינו הימנעות מזיהום באמצעות טיפות/תרסיס/דקירה מחפצים חדים. לפיכך למניעת חשיפה:

  1. אין לעבוד עם כלים חדים או העשויים מזכוכית (יש להשתמש רק בפיפטות עשויות פלסטיק, מחט קטומה וכדומה).
  2. סרכוז יתבצע רק בצנטריפוגת ביוהזרד.
  3. סינון יבוצע באמצעות ממברנה המורכבת במערכת תת לחץ (לפרטים פנה לממונה הבטיחות הביולוגית).
  4. העבודה תתבצע במנדף ביולוגי.

עפ"י החלטת ועדת בטיחות ביולוגית מכונית, העבודה עם וקטור לנטי תתבצע בחדר מחלקתי מיועד או בחדר תרביות רקמה של קבוצת המחקר (לאחר שאושר לשמש לעבודה עם וקטור לנטי על ידי ממונה הבטיחות הביולוגית) ובאחריות ראש הקבוצה. חדר התרביות הקבוצתי חייב להתנהל כולו לפי ההוראות מעלה גם כאשר לא מפיקים לנטי.

אנו ממליצים להשתמש בפלסמידים מהדור השלישי המאפשרים יצירת נגיף חסר יכולת התרבות, למשל Invitrigen Virapower, המומלץ על ידי מכוני הבריאות האמריקאים. מערכת זו כוללת מספר אמצעי בטיחות:

  1. הגן tat, החיוני להפעלת שעתוק גנים ויראליים, אינו מבוטא במערכת זו.
  2. הווקטור עובר השבתה עצמית מפעולה עקב חסר ב 3'LTR (U3).
  3. הגנים המקודדים לחלבונים מבניים ופונקציונליים חיוניים הוצאו מהווקטור ומוספים באופן זמני באמצעות שלושה פלסמידים (gag-pol , rev , VSV-G). ריבוי הפלסמידים (סה"כ ארבעה פלסמידים) מפחית את הסיכון ליצירת וקטור בעל יכולת התרבות.

העובדים עם לנטי דור 2 (סה"כ 3 פלסמידים) חייבים לבדוק בכל הפקה חדשה כי וקטור הלנטי אינו בר התרבות שכן כל הפקה הינה אירוע הסתברותי חדש (פרטים אצל ממונה הבטיחות הביולוגית).

ציוד ונהלי עבודה בלנטי וירוס

 

  1. ציוד חיוני בחדר בו מבוצעת עבודה בווקטורי לנטי:
  • מנדף ביולוגי (class II)
  • צנטריפוגה ביוהזארד
  • מיקרוסקופ
  • אינקובטור
  • ציוד לפסולת ביולוגית
  • מערכת מיקרו פיפטורים
  • ערכת טיפול בשפך הכוללת מגן פנים וערדליים
  1. כניסה לחדר:
    1. הגבלת הכניסה למורשים בלבד.
    2. על דלת החדר יוצב שילוט המציין: עבודה עם נגיף לנטי (ניתן להשיג ביחידת הבטיחות).

 

  1. לפני תחילת העבודה:
    1. יש להכין תמיסות חיטוי (ראה סעיף חיטוי).
    2. יש להכין שקית "ביוהזרד" בתוך המנדף ושקית נוספת בתוך דלי פסולת "ביוהזרד".
    3. יש ללבוש ציוד מיגון אישי: חלוק חד פעמי, 2 זוגות כפפות ומשקפי מגן.

את הכפפות החיצוניות יש להניח על שרוול החלוק על מנת להגן על אזור חיבור האמה לכף היד, או לעטות בשרוול חד פעמי עמיד למים מעל החלוק .

יש להוסיף למיגון זה מסכת פנים (surgical face mask) כאשר מתבצעת עבודה עם הווירוס כגון: איסוף/סינון/סרכוז/הדבקת תאים במנדף ביולוגי וכאשר הסיכון הוא זיהום הריריות באמצעות הידיים. ציוד מגן זה נקבע על סמך סקר סיכונים ובמטרה למנוע חשיפה דרך הריריות.

כאשר מדובר בעבודה היוצרת אירוסולים ואין אפשרות לבצעה במנדף, יש להתייעץ עם יחידת הבטיחות על מנת לבצע סקר סיכונים ובמקרה הצורך להוסיף ציוד מגן אישי נוסף.

  1. במהלך העבודה:
    1. יש לשמור על דלת חדר התרביות סגורה כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.
    2. יש להשתמש בטיפים ופיפטות בעלי פילטר.
    3. אין לעבוד עם כלים חדים או העשויים מזכוכית.
    4. יש לחטא ציוד חד פעמי (פיפטות, צלחות) לפני השלכתו לשקית ביוהזרד (ראה פרטים מטה).
    5. אין להכניס וקטורים או נגיפים אחרים למנדף כל זמן העבודה עם נגיף לנטי.
    6. אין להשאיר תמיסות המכילות נגיף, במנדף או בצנטריפוגה, ללא השגחה.
    7. אין לצאת ממעבדת לנטי עם החלוק אתו בוצעה העבודה עם הנגיף. ניתן להשאיר את החלוק החד פעמי בחדר הלנטי. בתום העבודה יש לזרוק את החלוק החד פעמי והכפפות בשקית ביוהזרד. מומלץ להכניסם לשקית חדשה.
    8. אם האינקובטור משמש לגידול תרביות תאים שאינן מודבקות בווקטור לנטי, מומלץ לגדל את תרביות התאים המודבקים בווקטור לנטי במדף התחתון של האינקובטור. יש להניח את צלחות תרביות התאים המודבקות בווקטור לנטי במגש,  במטרה להכיל שפך לא מתוכנן באינקובטור.
    9. לפני הוצאת הידיים מהמנדף יש להחליף כפפות חיצוניות  (ולזרוק אותן בשקית הביוהזרד במנדף). אין לגעת בציוד ומשטחים מחוץ למנדף בכפפות מזוהמות.
    10. סרכוז יבוצע בצנטריפוגת ביוהזארד או במבחנות סגורות באטם למניעת היווצרות תרסיס.
    11. שימוש באולטרה צנטריפוגה הממוקמת בחדר אחר יבוצע על פי ההוראות הבאות:
  • יש להציג שילוט המציין עבודה עם נגיף לנטי, משך העבודה, שמך ומספר טלפון נייד.
  • אין למלא מעבר ל75% מנפח המבחנה.
  • יש לאזן את המבחנות בשקילה בתוך המנדף בחדר הלנטי.
  • יש להניח בזהירות את המבחנות בתוך מיכלי המתכת.
  • יש לסגור את מיכלי המתכת בעזרת פקק מתכת מתאים (מכיל אטם).
  • יש לנקות את החלק החיצוני של המיכל עם אתנול 70% והחלף כפפות. הבא את המבחנות הסגורות לאולטרה צנטריפוגה המחלקתית בתוך מעמד.
  • בתום הצנטריפוגציה, יש לפתוח את המבחנות בתוך המנדף .
  • יש לחטא את מיכלי הצנטריפוגה (מבפנים ומבחוץ), הרוטור וקיר הצנטריפוגה עם אתנול 70%, או עם מטליות ייעודיות גם אם לא הבחנת בשפך.
    1. כל תהליך הכולל שימוש במכשור המוצב מחוץ לחדר תרביות/לנטי, או עבודה על שולחן המעבדה (למשל,FACS , מיקרוסקופיה, קצירת תאים), ניתן לבצע לאחר  ארבע שטיפות לתאים במדיום. שטיפה זו מבטיחה שמספר הוירוסים הנותרים בצלחת הינו פחות מהמנה הנדרשת להדבקה.

 

  1. בסיום העבודה יש:
  • לשטוף את צינור הגומי של משאבת הואקום בתמיסת סודיום היפוכלוריט מהולה  1:10 (0.6%).
  • לחטא את הפסולת המוצקה והנוזלית ולפנות אותן כמפורט מטה.
  • לנקות את המנדף, ידית האינקובטור וכל מכשור אחר שנעשה בו שימוש (מיקרוסקופ, צנטריפוגה וכו') באתנול 70% .
  • לשטוף ידיים עם סבון ומים במשך עשרים שניות לפחות.

 

 

חיטוי וטיפול בשפך המכיל לנטי

חיטוי:

אמצעי החיטוי המקובל הוא סודיום היפוכלוריט , שמצוי במחסן הכימיקלים כתמיסת 6% סודיום היפוכלוריט, מספר קטלוגי 020015987.

  • יש לשמור במנדף בקבוק המכיל תמיסה טרייה של 0.6% סודיום היפוכלוריט (החומר מאבד מפעילותו לאחר שנמהל ואינו פעיל תוך שבוע בלבד).
  • יש להכין בקבוק המכיל אתנול 70%.

חיטוי פסולת מוצקה: יש לחטא ציוד חד פעמי (כגון טיפים, פיפטות, בקבוקים, צלוחיות) במיכל המכיל 0.6% סודיום היפוכלוריט. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר ואת הפסולת המוצקה להעביר לשקית ביוהזרד. יש לסגור את השקית היטב (אך לא לאטמה) ולפנותה, כשהיא בתוך פח הביוהזרד, למיכל הפסולת המחלקתי.

חיטוי פסולת נוזלית:

נפחים הקטנים מ 500 מ"ל ניתן לחטא בתוך המנדף בבקבוקי פלסטיק (למשל בקבוקי מדיום או PBS) המכילים עשירית מהנפח תמיסת סודיום היפוכלוריט 6%. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר. יש לשים לב שהפסולת אותה משליכים לכיור אינה מכילה טיפים שיסתמו את ביוב הכיור, מומלץ להשתמש במסננת.

נפחים הגדולים מ 500 מ"ל יש לחטא במלכודת המחוברת למערכת שאיבה והמוגנת על ידי מערכת "מלכודת" כפולה ופילטר 0.2 מיקרון (Midisart® 2000 מק"ט 17805 UPN). על המלכודת להכיל עשירית הנפח תמיסת סודיום היפוכלוריט 6%. לאחר חצי שעה ניתן לשפוך את הנוזל המחוטא לכיור שבחדר.

טיפול בשפך קטן

יש לכסות את השפך בנייר מגבת ובזהירות לשפוך על הנייר, מהחוץ פנימה, תמיסת 0.6% סודיום היפוכלוריט. לאחר 20 דקות לאסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד.

טיפול בשפך גדול

יש לעטות מסיכה 8835, לכסות את נעליך בערדליים ולחבוש מקפי מגן או מגן פנים למניעת התזה תוך כדי תהליך הטיהור. יש לכסות את השפך בנייר מגבת ובזהירות לשפוך על הנייר, מהחוץ פנימה, תמיסת 6% סודיום היפוכלוריט (1/10 של נפח השפך).לאחר 20 דקות צריך לאסוף את הנייר לתוך שקית ביוהזרד. במקרה הצורך דווח למוקד לקבלת עזרה 08-9342999.

במקרה של חשיפה עורית, צריך לרחוץ פעמיים את האזור הנגוע במים ובסבון למשך 30 שניות לפחות. חובה לדווח לראש הקבוצה ולמוקד 08-9342999.

במקרה של התזה לעין יש לשטוף עם מים במשך 15 דקות לפחות לדווח לראש הקבוצה ולמוקד 08-9342999.